BIOCHIMIE EXPERIMENTALE 1

EXTRACTION DE L’ALBUMINE DU SERUM PAR CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITE

BUT
Le but de ce TP sera d’extraire l’albumine d’un sérum en utilisant une chromatographie d’affinité, de déterminer la concentration d’albumine dans le sérum, puis de vérifier, à l’aide d’une électrophorèse, que la chromatographie a correctement fonctionné.

PRINCIPE
Chromatographie d’affinité sur Bleu Sepharose CL-6B
La chromatographie d’affinité se fait avec une résine sur laquelle nous avons fixé un ligand ayant une affinité pour cette molécule. Ce ligand se lie spécifiquement à la molécule. L’adsorption consiste à mettre en présence un mélange contenant la molécule d’intérêt et la résine contenant le ligand, dans des conditions favorables à la liaison ligand-molécule spécifique. Les molécules n’ayant pas d’affinité pour le ligand ne se fixeront pas sur la résine et pourront être éluées, tandis que celles ayant une affinité resteront attachées. Ensuite, quand toutes les molécules sans affinité sont complètement éliminées, nous procédons à la désorption des molécules restées attachées au ligand. Ceci se fait en exposant le complexe résine-molécules spécifiques à des conditions physico-chimiques où l’interaction ligand-molécules spécifiques est moins stable. Ces dernières se détacheront alors de la résine, élueront dans le solvant de désorption et pourront être récupérées.
L’élution s’effectue dans un collecteur de fractions programmé à 1,5mL (soit 50 gouttes) car le volume utilisé pour le dosage spectrophotométrique de la gamme étalon est de 1,5mL. Chaque tube dosé doit avoir le même volume (1,5mL), auxquels nous ajoutons 2mL de Biuret.

Réaction du Biuret
La réaction du Biuret est la formation d’un complexe pourpre entre le Biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2) et de deux liens peptidiques consécutifs en présence de cuivre en milieu alcalin. Le complexe de coordination résultant absorbe fortement dans le bleu (540nm). Ce qui permet de doser les protéines par